蒙永祥　張　玲①　黃春龍　林學顏②　(廣東省大日生物化學藥業(yè)有限公司,廣州 510507)

　　中國圖書分類號　R730　　文獻標識碼　A　　文章編號　1000-484X(2004)06-0393-03

　　[ 摘　要] 　目的:應用咽喉分離的細菌混合抗原免疫母雞, 提取雞蛋黃中 IgY, 通過 ELISA 方法證實 IgY 抗體的特異活性。方法:采取咽喉炎相關的多種細菌作抗原免疫產(chǎn)蛋母雞 , 收集雞蛋, 從蛋黃中提取 IgY, 經(jīng)純化后進行 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和抗體活性的 ELIAS 測定。 結果:電泳呈現(xiàn)12 條帶, 證明IgY 抗體中至少有 12種抗體成分 , ELISA 結果表明 IgY 抗體效價為1∶512。 熱穩(wěn)定性試驗結果顯示, 在 37℃溫度下, IgY 抗體活性無改變。 結論:應用多種混合的細菌抗原免疫母雞, 其雞蛋黃中含有相應的 IgY 抗體成分, 對熱具有高度穩(wěn)定性。

　　[ 關鍵詞] 　雞蛋黃;免疫球蛋白 IgY;細菌復合抗原;抗體

Study on the activity of IgY against complex bacteria in pharynx and throat

MENGYong-Xiang ,ZHANG Ling , HUANG Chun-Long ,LIN Xue-Yan .Great Sun Company of Biochemistry Pharmacolo-gy ,Guangzhou 515007, China

     [ Abstract] 　Objective:To detect the activity of IgY against complex bacteria in pharynx and throat.Methods:Purified antigens against bacteria in pharynx and throat was used to immunize egglaid hens.The eggs from immunized hens were collected and abstract IgY from the yolks.The antibody activity of IgY was detected by SDS-PAGE electrophoresis and ELISA.Results:SDS-PAGE electrophoresis represented at least twelve ladders, and the titer of ELISA was 1∶512.Conclusion:IgY antibody was obtained in egg yolk after immunized henswith complex bacteria.The activity of IgY was detected.IgY showed stable to heat.

      [ Key words] 　Egg yolk;Immunoglobulin yolk IgY;Bacteria complex antigen;Antibody

　　采用雞作為免疫宿主產(chǎn)生大量有效的免疫球蛋白 IgY 是收集抗體的好方法。Klemperer 在 1893 年已指出母雞的抗體是從血清傳遞至蛋黃中, 授予雞胚胎或雛雞的被動免疫性。1981 年 Jensenius 等 , 通過實驗證實鳥類就像哺乳類動物一樣, 用抗原免疫的母雞產(chǎn)生抗體的免疫性可以通過血清轉遞至蛋黃中,以保護其子代。由于在雞體內(nèi)只有 IgG 分子能通過卵黃囊轉輸至蛋黃中, 因此用抗原免疫的母雞所生的雞蛋黃中只有 IgG 分子, 因雞蛋黃的英文名稱為“Yolk”, 特取它的第一個字母“Y”為代表, 將雞蛋黃中的免疫球蛋白 IgG 稱之為 IgY(ImmunoglobulinYolk,IgY)。IgY的優(yōu)點是由于它的種系發(fā)生距離較遠[ 1],IgY 抗體可以識別一些哺乳類動物相同類型的蛋白質(zhì) ,使它得到更廣泛的應用 ,以常規(guī)的免疫學方法獲得 IgG 抗體和 IgY 抗體相比較 ,免疫一只兔每月可獲得 200 mg IgG(特異性抗體約 5%), 雞的IgY抗體每月可收獲 1 500 mg(特異性 IgY 為 2%～10%)[ 2]。Fis-cher 等人的研究也指出 IgY 抗體具有無需放血, 僅收集免疫的雞蛋, 即可從蛋黃中獲得①中山大學腫瘤防治中心實驗研究部, 廣州 510089②中山大學中山醫(yī)學院免疫學教研室, 廣州 510089

作者簡介:蒙永祥(1959 年-), 男, 副主任醫(yī)師, 主要從事新藥研制開發(fā)。大量而效價持久的 IgY 抗體, 方便而經(jīng)濟, IgY 的分離快速而簡單等特性[ 3]。
　　本文應用引起咽喉炎和扁桃體炎的病原菌免疫產(chǎn)蛋的母雞 ,提取雞蛋黃中 IgY抗體,并采用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳檢測其抗體成分,ELISA 測定其活性[ 4],并進行 IgY熱穩(wěn)定性試驗 。結果證實雞蛋黃中 IgY 抗體的特異性活性, 為免疫球蛋白 IgY在臨床診斷與治療的應用提供了有力的依據(jù) 。

1材料與方法

1.1　動物　來亨雞購于華南農(nóng)業(yè)大學 。

1.2　抗原　多種細菌復合抗原由廣東省大日生物化學藥業(yè)有限公司和美國雅臣藥業(yè)集團有限公司提供 ,其中含金黃色葡萄球菌 、白色葡萄球菌、β-溶血性鏈球菌 、G 簇溶血性鏈球菌、肺炎球菌、類白喉桿菌 、乳桿菌 、大腸埃希氏菌、擬桿菌等研制“喉友”咽喉噴劑的細菌復合抗原 ,凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3　免疫 　新產(chǎn)蛋母雞兩只, 每只分別于雙翅皮下 、背部兩側皮下、腹部和雙腿部皮下注射, 每周 1次 ,每次注射抗原 1 ml(加完全福氏佐劑),共 4 次,最后一次注射后 3 天,加強免疫一次,一周后開始收

集雞蛋 ,置 4℃冰箱保存?zhèn)溆??！?393 · 蒙永祥等　抗咽喉細菌復合抗原的 IgY 抗體活性研究　第 6 期

1.4　IgY抗體的純化 　雞蛋外殼經(jīng)消毒后, 剪一小孔,吸除蛋白,分離提取蛋黃液 ,加 9 倍體積 pH7.0,0.1 mol L 磷酸緩沖液(含 0.06 mol L NaCl), 置電動攪拌器攪勻 ,應用 10 mg ml 蛋黃液, 上 DEAE-Sepha-dex A50柱(2.5×3.5 cm)濾過 ,分部收集(20 ml h),5.0 ml 分部 。取每峰洗脫液, 以 ELISA 方法測定抗體活性,用 0.22 μm 濾膜除菌并凍干 。

1.5　ELISA 試驗 　按常規(guī)方法進行。羊抗雞 IgG-HPR(生產(chǎn)廠家 KPL , Size :0.05 mg , 使用濃度范圍 :1∶500～ 1∶2 500)。
1.5.1　包被抗原:酶標反應板在包被前用緩沖液洗滌3 次,甩干, 每排 1～ 10 孔加抗原 0.1 ml 包被 , 12 孔加包被液 0.1 ml ,置 4℃過夜 。
1.5.2　次日傾去所有液體 , 以洗滌液洗 4 次 , 每孔加5%小牛血清稀釋液 0.1 ml , 置 37℃培養(yǎng)箱封閉40 分鐘(或置 4℃過夜),洗 4 次 。
1.5.3　加樣:取上述純化的待測 IgY抗體, 用 5%小牛血清稀釋液按 1∶2 、1∶4、1∶8 等倍比稀釋至1∶1 024, 第 1～ 10孔分別加等比稀釋液 0.1 ml ,每個稀釋度設 3 個復孔,第 12 孔加 5%小牛血清 0.1 ml ,置37℃培養(yǎng)箱孵育 40分鐘后 ,取出洗 4次 。
1.5.4　每孔加入羊抗雞 IgG-HRP 抗體 0.1 ml , 置37℃培養(yǎng)箱 40 分鐘,然后洗 4 次。
1.5.5　顯色:每孔加入酶免底物一滴, 顯色后再加一滴終止液,終止顯色反應。

1.6　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 　取 SDS-聚丙烯酰胺凝膠 1 支, 溶于 200 ml 雙蒸水 , 分裝小管 ,10μl 管 ,取一管加 Tris-HCl 緩沖液 10 μl ,室溫融化后 ,在沸水浴中加熱 5 分鐘后上樣。電泳時間為 50 分鐘,干膠后 ,用考馬斯蘭 R-250染色, 觀察結果。

1.7　IgY熱穩(wěn)定性試驗　將純化的 IgY抗體原液,分別置37℃、45℃、55℃、65℃、75℃, 15 分鐘后, 以上述緩沖液稀釋500 倍, 進行 ELISA 試驗 。

2　結果

2.1　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結果 　純化的雞蛋黃 IgY 經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后用考馬斯蘭R-250染色, 顯示 12 條帶(見圖 1)。

2.2　ELISA 測定結果 　按上述操作后, 酶標板置酶標儀 450 nm 波長,檢測 OD 值 ,以 P N 值 ≥2.1 為陽性 ,結果如表 1。由表 1可以看出,根據(jù)P N 值 ≥2.1為陽性 , 當倍比稀釋度到 1∶512 時仍為陽性 , 表明“喉友”口腔噴劑中 IgY 濃度達到該水平即可檢出,即其效價為 1∶512。

2.3　IgY 熱穩(wěn)定性 　37 ℃15 分鐘 , IgY 抗體的活性幾乎無變化, 在 45℃、55℃、65℃15 分鐘, IgY 抗體活性下降約30%,在 75℃其活性迅速下降 。

Fig.1　Result of SDS-PAGE electrophoresis for IgYNote:1, 2.purifyied IgY;M .marker.

3　討論

       據(jù)考證 IgY 的進化已有 300 億年的歷史 , 從它的進化過程表明 IgY 的功能可能是從 IgG 進化的 ,而且是較高級的抗體 。IgY 存在于多種動物中 , 由較低等的動物、兩棲類脊椎動物, 以至高級的鳥類 ,在這些不同種屬的動物中 ,IgY 是血液中的 IgG 透過卵黃囊轉遞至蛋黃中的免疫球蛋白 ,近年來已經(jīng)由許多免疫學家研究證實, 蛋黃中的 IgY 十分濃集, 滴度比血液 IgG 至少高一個滴度。我們實驗室測定結果也表明蛋黃 IgY 濃度比血液 IgG 高一個滴度 。由于IgY 的種系發(fā)生與哺乳動物 IgG 抗體的相距較遠。因此, 采用抗原免疫產(chǎn)蛋母雞從雞蛋黃中可以收集到大量純度高的 IgY, 可作為醫(yī)學上的診斷試劑和治療制劑[ 5,6],其優(yōu)點之多是免疫哺乳類動物不可替代的 ,用抗原免疫母雞收集雞蛋方便,無需放血和宰殺動物并可大量連續(xù)地收集雞蛋提取 IgY, 源源不斷地為診斷試劑和治療制劑提供原料。

       本實驗應用咽喉炎、扁桃體炎患者炎癥局部常見細菌和正常人咽喉部分離的細菌 , 如A 簇 β 型溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌 、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌等細菌混合免疫來亨雞 ,再從免疫母雞的雞蛋黃中提取獲得 IgY 抗體, 經(jīng) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后所呈現(xiàn)的 12 條帶 ,說明了本實驗應用細菌免疫母雞能夠得到相應的 IgY 抗體 , 在ELISA 實驗中也得到了證實;本實驗對 IgY 抗體的穩(wěn)定性也進行了研究 ,結果表明 IgY抗體在 37℃條件下穩(wěn)定性好 , 適于大量制備和保存 。多年來人們一直沿用傳統(tǒng)的免疫學方法 ,利用抗原免疫哺乳動物 ,例如鼠 、兔 、羊或馬等, 再抽取血液分離血清 ,從中提取免疫球蛋白抗體 , 用于研制各種生物藥物和診斷試劑 ,為人類疾病的診斷治療和預防作出了巨大的貢獻 。隨著科學的飛速發(fā)展, 從免疫母雞所生的雞蛋黃中提取 IgY 抗體制備生物診斷試劑和治療制劑是一項嶄新的技術 , 它有可能逐漸替代應用免疫動物提取血清免疫球蛋白的傳統(tǒng)方法。

4　參考文獻

1　Gassmann M, ThommesP , Weiser T et al .Efficient production of chickenegg yolk antibodies against a conserved mammalian protein[ J] .FASEB J,1990;4:2528-2532.

2　Schade R, Burger W, Schoneberg T et al .Avian egg yolk antibodies, theegg-laying capacity of hens following immunization with antigens of differ-ent kind and origin and the efficiency of egg yolk antibodies incomparisonto mammalian antibodies[ J] .Altex Alternativen ZU Tierexp, 1994;11:75-84.

3　Fischer M, Hinak A ,Montag T et al .Comparison of standard methods forthe preparation of egg yolk antibodies[ J] .Tierarztliche Praxis, 1996;24:411-418.

4　Larsson A.Determination of circulating immune complexes by chicken an-ti-human C3 and anti-human C1q micro ELISA[ J] .J Immunol Methods,1998;113(1):93.

5　Gardner P S, Kaye S.Egg globulin in rapid virus diagnosis[ J] .J VirolMethod, 1982;4(1):257.

6　Carlander D ,Kollberg H, WajakerP E et al .Peroral immunotherapy withyolk antibodies for the prevention and treatment of enteric infection[ J] .Immunol Res,2000;21:1-6.

[ 收稿 2003-04-02　修回 2003-05-19]

(編輯　許四平)